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产品简介

Biozol 可从各种真核培养细胞，动物组织， 细菌植物和真菌中快速高效提取总RNA， 整个实验可控制在30分钟内。 通常情况下可单次处理1 x 106个真核细胞， 1 x 109 个细菌细胞， 100 mg 动物或植物组织。
本试剂盒纯化的RNA可用于RT-PCR, Northern 杂交， mRNA纯化，体外翻译等下游实验。
原理
细胞或组织经Biozol裂解， 试剂中的成分会抑制RNase活性。 加入氯仿抽提， 裂解液将分为水相和有机相。 RNA存在于水相中， 用异丙醇处理水相后,经过75%酒精的洗涤， 室温晾干或真空干燥后用DEPC水洗脱就能得到高质量的RNA。
贮存条件及其稳定性
Biozol 试剂保存于4℃。 该产品可保证在购买之日起至少24 个月內有效。
产品组分

注： Biozol 溶液包含异硫氰酸胍和苯酚， 实验时请格外小心。
操作前请注意
仔细阅读说明书，熟悉相关步骤， 并准备好相关器材。

实验时， 戴好一次性手套减少RNase污染，使用一次性的RNase-free 枪头。
实验操作尽量小心快速。

实验前要确定使用的样品量， 最大用量是100 mg， 一些富含RNA的组织，我们建议使用30 mg的样品。 如果一些RNA含量佷少的样品， 那么样品使用量增大为100 mg。
组织匀浆
A. 液氮研磨
液氮研磨组织并立即置于液氮中冷冻，液氮下将组织研磨成细粉，将悬浮的粉末倒入预冷的离心管中， 注意预先冷却离心管，否则样品倒入时，液氮沸腾会损失样品。在样品融化前， 加入Biozol试剂。
B. 转子匀浆机匀浆
带转子的机械匀浆器能高效、方便地匀浆大部分组织。 大部分匀浆器都带有不同大小的针头， 可处理比较微量的组织。
C. 注射器方法
由于高分子量DNA会提高细胞裂解液粘度，因为可以用小型针头（19-21型） 抽打几次以打断DNA， 降低裂解液的粘度。
需用户准备的试剂
� 氯仿
� 异丙醇
� 无水酒精
RNA提取操作步骤
A ： 真核细胞和组织RNA提取步骤
1. 用1 mL Biozol 试剂 裂解细胞或组织
1 mL Biozol溶液可以充分裂解107个细胞，或是100mg剪碎的组织（30mm3）
对于单层培养细胞（成纤维细胞， 内皮细胞等）
按下面的方法在培养瓶中直接裂解细胞： 尽量吸干培养基，然后直接将Biozol 溶液加入到培养皿。 用裂解液吸打培养皿上面的细胞，使全部细胞都裂解。转移裂解液到1.5mL的离心管。 （这个办法比用胰酶消化收集细胞好一些，因为这样可以最大限度降低RNA酶对RNA的降解。）
对于悬浮培养细胞

用不超过1,500 rpm (400 x g) 离心 5分钟.弃上清， 加入Biozol溶液， 漩涡混匀或枪头吸打混匀。 然后转移到1.5mL离心管。
对于组织样品
按照样品的类型，选择一个较好的匀浆方法。除了液氮研磨以外，其他匀浆方法可直接在Biozol溶液 中操作。 其中对于特殊组织样品如：肝、脾、骨及软骨等需要将Biozol用量加大一倍或是降低样品量。
2. 在室温下，静置两分钟。
3. 每1 mL Biozol 溶液加入0.2倍体积的氯仿（1 mL Biozol Reagent 对应加入0.2 mL 氯仿） ， 盖好盖， 用手剧烈震荡15秒。
4. 4oC 下12,000 xg 离心 3 分钟。 溶液分为酚氯仿相、 中间相和上层水相。RNA溶解在水相中。
5. 转移不超过80%的水相到一个干净的离心管， 然后加入0.5倍体积的异丙醇(96-100%,室温)，漩涡充分震荡15秒。
6. 4oC 下12,000 x g 离心 10 分钟， 离心后试管底部将出现沉淀。
7. RNA沉淀的清洗： 沿管壁轻轻加入1mL 75%的乙醇（防止加入乙醇时冲散沉淀） ， 用手轻轻震荡离心管洗涤沉淀。 7500×g离心5分钟， 弃上清， 尽量去除残留乙醇， 这样可以减少盐离子污染。
8. 重复第7步。
9. RNA的溶解： 室温晾干或真空干燥， （不要过于干燥， 否则RNA很难溶解） 然后加入30-50 µL DEPC 水溶解RNA， 待沉淀完全溶解后于-80℃保存。
B： 细菌RNA提取步骤
1. 采集菌体后悬浮于100 µL TE/lysozyme， 室温下静置7分钟
估算好细菌数， 109个菌体为佳， 4,000 x g 离心 5 分钟，弃上清， 加入100µL 已添加溶菌酶的TE buffer。 （革兰氏阴性菌加入0.5 mg/mL的溶菌酶;革兰氏阳性菌4mg溶菌酶/mL的溶菌酶） 悬浮菌体， 然后室温下静置7分钟。
2. 加入1mL Biozol 溶液， 漩涡震荡15 秒。 室温静置3分钟。
3. 每1 mL Biozol 溶液加入0.2倍体积的氯仿， 盖好盖， 用手剧烈震荡15秒。
4. 4oC 下12,000 x g 离心 3 分钟 。溶液分为酚氯仿相、中间相和上层水相。RNA溶解在水相中。
5. 转移不超过80%的水相到一个干净的离心管， 然后加入0.5倍体积的异丙醇((96-100%,室温)， 漩涡充分震荡15秒。 这一步可能会瞬间产生沉淀， 这不影响RNA的纯化。
6. 4^oC 下12,000 x g 离心 10 分钟， 离心后试管底部将出现沉淀。
7. 按照第5页的方法操作7-9步。
C： 植物和真菌RNA步骤
按照这个实验步骤可以简单高效的从新鲜或冷冻的组织中高效的提取RNA 。 鉴
于真菌和植物水分含量不一、变化幅度大， 而且含有多糖类，所以每次取样不要超过100mg。 最好采集嫩叶或芽。 按照实验步骤提取的 RNA足够应用于Northern分析。
实验中穿戴乳胶手套， 把样品放于1.5或2.0mL的离心管， 然后用镊子夹取到液氮中冷冻，应用一次性的研钵研磨或其它器具研磨。 研磨过程中保持液氮蒸发， 研磨后的样品可直接保存于-70 ℃。
1. 采集研磨好的冷冻组织到离心管， 然后迅速加入1mL Biozol 溶液，漩涡充分震荡30秒。保证所有的凝块全部溶解。 溶解完全对RNA提取很关键。
2. 室温下静置3分钟。
3. 每1 mL Biozol 溶液中加入0.2 mL的 氯仿。 盖好盖， 漩涡剧烈震荡15秒。
4. 4oC 下12,000 x g 离心 3 分钟。溶液分为酚氯仿相、 中间相和上层水相。
RNA溶解在水相中。
5. 转移不超过80%的水相到一个干净的离心管， 然后加入0.5倍体积的异丙醇((96-100%,室温)， 漩涡充分震荡15秒。 这一步可能会瞬间产生沉淀， 这不影响RNA的纯化。
6. 4oC 下12,000 x g 离心 10 分钟， 离心后试管底部将出现沉淀。
7. 按照第5页的方法操作7-9步。
Biozol RNA 提取试剂 Page 7
DNA污染
应用ezBind RNA spin柱可以去除绝大多数的DNA， 一般的RNA提取都不能完全去除基因组残留。 对于下游敏感实验如： RT-PCR或差异显示， 我们建议在膜上进行DNA消化。 应用RNase-free的DNase来进行消化。 在一些RTPCR，如果应用体表表达引物，在有微量的DNA污染也无影响。 拨打热线858-603-3219，我们这里提供体外引物的构建合成。
RNA的定量和存储
测定260 nm 和 280 nm的吸光值可以测定RNA的浓度。 260nm1个OD值表示溶液RNA浓度是40 µg/mL,DEPC水呈酸性，会显著降低260nm的吸光值。 我们 建议使用TE缓冲液来稀释RNA进行OD值的测定。 纯净的RNA的OD A260/A280 比值是2.纯净的蛋白质OD A260 /A280的比值是0.6左右。 比值在1.8-2.0之间的话表示RNA纯度是90%-100%。 （苯酚的最高吸光值在275nm， 会影响DNA和RNA的吸光值， 但是EzgeneTM Total RNA Kit解决了苯酚对吸光值的影响。 ） RNA溶于水后储存于-70oC。 按照上面的方法提取的RNA可以保存超过一年。
RNA质量
注意 ：在以后的应用前推介先测定 RNA 的质量。 收集的 RNA 质量可以用加入染色剂溴化乙锭的变性凝胶琼脂进行电泳的办法测定。我们将看到非常清晰的 28s and 18s 族 RNA 的特定条带。 如果这些条带不清晰并倾向于形成小分子 RNAs，这种情况说明在原料准备或操作过程或储备中 RNA 发生了很严重的降解。 小于 200 碱基片段的 RNA 不能有效的结合到 RNA 柱子上。
吸光值 A260/A280的比率在 1.8-2.0 说明提取的 RNA 的纯度在 90-100%

 疑难问题解答